Takaisin

Tärkeät tekijät silsan diagnostiikassa

Näytönastekatsaukset
Elina Aho-Laukkanen
4.3.2021

Näytön aste: A

Nukleiinihappojen monistukseen perustuvat menetelmät ovat nopeampia ja herkempiä menetelmiä silsanäytteiden laboratoriodiagnostiikassa sieniviljelyyn verrattuna.

Ruotsalaisessa alkuperäistyössä «Bergman A, Heimer D, Kondori N ym. Fast and specif...»1 kehitettiin PCR-menetelmä kaikkien tunnettujen dermatofyyttilajien osoittamiseksi käyttämällä tutkimusmateriaalina ATCC-referenssikantoja (Trichophyton-, Candida- ja Aspergillus-lajeja) ja kliinisiä potilasnäytteitä. Tutkimuksessa oli mukana 202 kliinistä potilasnäytettä (kynsi-, iho- ja hiusnäytteitä) Skövden sairaalasta (Ruotsi). PCR-alukkeina käytettiin pan-dermatofyyttialuketta sekä spesifisiä alukkeita T. rubrum- ja T. interdigitale -lajeille (duplex-PCR). Monistustuotteille tehtiin sulamiskäyräanalyysi. Ristiriitaisen tuloksen viljelyllä ja PCR:llä antaneet näytteet sekvensoitiin.

PCR-menetelmällä positiivisia näytteitä oli 103 (51 %) ja viljelyllä positiivisia 79 (39 %). Molemmilla menetelmillä positiivisia näytteitä oli 75. PCR-positiivisista näytteistä 102 tunnistettiin lajitasolle duplex-PCR:llä. Näistä 91 % tunnistettiin T. rubrum- ja 8 % T. interdigitale -lajeiksi. Viljelyllä positiivisista näytteistä 75 löydöstä tunnistettiin lajitasolle. 3 viljelypositiivista näytettä oli PCR-negatiivisia. 5 näytteestä tunnistettiin viljelyllä ja PCR:llä eri dermatofyyttilajit. 1 näyte oli pan-dermatofyytti-PCR:llä positiivinen, mutta viljelyllä negatiivinen. LCA:lla (latent class analysis) arvioitiin duplex-PCR:n herkkyydeksi 1,0 ja viljelyn 0,77.

PCR-negatiiviset tulokset viljelyllä dermatofyyttipositiivisista näytteistä (3 kpl) saattoivat johtua näytteen epähomogeenisuudesta. Viljelyllä negatiivisten, mutta PCR-menetelmällä positiivisten näytteiden (27 kpl) todettiin olevan todennäköisesti oikeita positiivisia, koska PCR-menetelmällä positiiviset tulokset voivat olla peräisin myös kuolleesta tai kasvukyvyttömästä sienestä, jolloin viljely jää negatiiviseksi. Lajitunnistukseltaan ristiriitaiset näytteet (6 kpl) sekvensoitiin, mutta sekvensointi onnistui vain 3 näytteen kohdalla. Näille 3:lle sekvensointi antoi saman tuloksen kuin PCR.

Yhteenvedossa todetaan, että tutkimuksessa kuvailtu reaaliaikainen PCR-menetelmä yhdistettynä sulamiskäyräanalyysiin mahdollistaa herkemmän ja merkittävästi nopeamman silsasienidiagnostiikan verrattuna sieniviljelyyn.

  • Tutkimuksen laatu: tasokas
  • Sovellettavuus suomalaiseen väestöön: hyvä

Kiinalaisessa alkuperäistyössä «Bao F, Fan Y, Sun L ym. Comparison of fungal fluor...»2 arvioitiin fluoresenssivärjäystä ja ITS-rDNA-PCR-pohjaista sekvensointia onykomykoosin diagnostiikassa. Tutkimuksen näytemateriaalina oli 204 kliinistä näytettä (107 varpaankynnestä ja 97 sormenkynnestä) 187 potilaalta, joilla epäiltiin onykomykoosia. Potilaita, jotka olivat käyttäneet ulkoista tai sisäistä sienilääkitystä 2 edellisen viikon aikana, ei otettu tutkimukseen mukaan. Näytteet jaettiin 4 osaan KOH-värjäystä (suora mikroskopointi), viljelyä, fluoresenssivärjäystä ja PCR-sekvensointia varten. Oikeaksi positiiviseksi tutkimuksessa määriteltiin perinteisillä menetelmillä eli KOH-värjäyksellä ja/tai viljelyllä positiivinen näyte.

Suoralla mikroskopoinnilla positiivisia näytteitä oli 103 (51 %) ja viljelyllä 87 (43 %). Sekä suoralla mikroskopoinnilla että viljelyllä positiivisia näytettä oli 69 (34 %). Fluoresenssivärjäyksellä positiivisia näytteitä oli yhteensä 126 (62 %) ja PCR-sekvensoinnilla 102 (50 %). Verrattuna perinteisiin menetelmiin fluoresenssivärjäyksen herkkyys ja tarkkuus olivat 97 % ja 89 % sekä vastaavasti PCR-sekvensoinnin 78 % ja 90 %. Fluoresenssivärjäys lisäsi suoran mikroskopoinnin herkkyyttä 12 % verrattuna KOH-värjäykseen. PCR-sekvensointi lisäsi herkkyyttä 6 % verrattuna viljelyyn. PCR-sekvensoinnilla 18 viljelyllä negatiivisesta näytteestä löytyi dermatofyytti-DNA:ta (T. rubrum).

Yhteenvedossa todetaan, että PCR-sekvensointi oli nopeampi ja herkempi menetelmä verrattuna viljelyyn. PCR-sekvensointi yhdistettynä fluoresenssivärjäykseen tarjoaa kliinikoille luotettavan diagnoosin potilaiden hoitoa varten.

  • Tutkimuksen laatu: tasokas
  • Sovellettavuus suomalaiseen väestöön: hyvä

Israelilaisessa alkuperäistyössä «Sherman S, Goshen M, Treigerman O ym. Evaluation o...»3 kehitettiin Israelissa yleisimpien dermatofyyttien osoittamiseksi multiplex-RT-PCR-menetelmä, jota verrattiin perinteisiin sienidiagnostiikan menetelmiin. Kliininen potilasnäytemateriaali koostui iho-, hius- ja kynsinäytteistä ja oli peräisin 3 eri taholta: RMC:n (Rabin Medical Centre) sairaalan dermatologian klinikan mikrobiologian laboratoriosta, avoterveydenhuollon mykologian laboratoriosta (Meuhedet Health Services) ja Israelin puolustusvoimien mikrobiologian laboratorioista. Näytteet homogenisoitiin ja jaettiin 3 osaan KOH-värjäystä, viljelyä ja RT-PCR-menetelmää (ITS (internal transcribed spacer) 1 ja 2) varten. Alukkeet ja koettimet suunniteltiin tunnistamaan seuraavat 7 dermatofyyttilajia: T. rubrum, T. tonsurans, T. violaceum, T. mentagrophytes (var. interdigitale, mentagrophytes, erinacei), M. canis, M. gypseum ja E. floccosum.

RMC:n sairaalapotilaiden 223 näytteestä 190 näytteen tulokset olivat yhteneviä PCR:llä ja perinteisillä menetelmillä. PCR:llä osoitettiin 22 (10 %) dermatofyytti-infektiota, joiden kohdalla viljely oli negatiivinen. Ristiriitaisen tuloksen antaneita näytteitä oli 33, joista 25 olivat positiivisia PCR:llä, mutta negatiivisia viljelyllä ja/tai värjäyksellä. 8 näytettä oli PCR:llä negatiivisia, mutta viljelyllä ja/tai värjäyksellä positiivisia.

Vertailukohorteissa RT-PCR-menetelmällä positiivisia näytteitä oli 59 % avoterveydenhuollon näytteistä ja 66 % armeijan henkilökunnan näytteestä. Molemmissa kohorteissa RT-PCR tunnisti kaikki viljelyllä ja värjäyksellä positiiviset tapaukset. Lisäksi RT-PCR:llä osoitettiin avoterveydenhuollon ja armeijan henkilökunnan näytteistä 15 % ja 30 % enemmän dermatofyyttilöydöksiä kuin viljelyllä. Armeijan henkilökunnan näytteistä sekvensoitiin 43 ristiriitaista näytettä. Sekvensointi antoi yhtenevän tuloksen PCR:n kanssa 41 näytteelle (95 %). PCR-positiivisten tulosten määrässä ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa tutkimuksen 3 eri tahon näytteissä (67 %, 59 % ja 66 %, p = 0,214).

Johtopäätöksissä todetaan, että tutkimuksessa kehitetty RT-PCR-menetelmä on yksinkertainen, nopea ja automatisoitu. RT-PCR-menetelmällä voitiin osoittaa merkittävästi enemmän dermatofyyttejä kuin perinteisillä menetelmillä.

Tulosten perusteella kirjoittajat ehdottavat kyseessä olevaa RT-PCR-menetelmää käytettäväksi ensimmäisen vaiheen testinä pinnallisten sieni-infektioiden diagnostiikassa.

  • Tutkimuksen laatu: tasokas
  • Sovellettavuus suomalaiseen väestöön: hyvä

Yhdysvaltalaisessa alkuperäistyössä «Gustafson E, Bakotic W, Bennett L ym. DNA-based de...»4 vertailtiin sieniviljelyä, histologista värjäystä ja PCR-menetelmiä onykomykoosin diagnosoimisessa. Tutkimuksen näytemateriaalina käytettiin kliinisiä kynsinäytteitä potilailta, joilla epäiltiin onykomykoosia. Tutkimuksessa analysoitiin 425 kynsinäytettä sieniviljelyllä ja PCR-menetelmällä. Ristiriitaisen tuloksen (viljely vs. PCR) antaneet näytteet sekvensoitiin. Lisäksi tutkimuksessa analysoitiin 2 452 kynsinäytettä viljelyllä, PCR-menetelmällä ja histologisella PAS-värjäyksellä. Näytteille suoritettiin ensin PCR-seulontatesti, jolla tutkittiin, sisälsikö näyte dermatofyyttiä, saprofyyttiä tai hiivaa. Jos seulontatesti oli positiivinen, suoritettiin spesifisempi PCR-tutkimus tarkemman suku- tai lajinimen selvittämiseksi.

Viljelyllä ja PCR:llä positiivisia näytteitä oli 425 näytteestä 219 (52 %). Ristiriitaisista näytteistä (206) 95 %:lle PCR antoi saman tuloksen kuin varmistustestinä käytetty DNA-sekvensointi. Laajemmassa 2 452 näytteen tutkimusmateriaalissa positiivisia näytteitä oli histologisella värjäyksellä 85 %, PCR:llä 73 % ja viljelyllä 54 %. Lisäksi 48 % PCR:llä ja 51 % histologialla positiivisista näytteistä olivat negatiivisia viljelyllä. Histologiseen värjäykseen verrattuna PCR oli herkempi ja tarkempi kuin viljely, ja PCR:n positiivinen ja negatiivinen ennustearvo olivat korkeammat kuin viljelyn.

Pohdinnassa todetaan, että onykomykoosi on yleinen sairaus, ja sen esiintyvyys on lisääntymässä. Onykomykoosiin voi liittyä myös komplikaatioita, joten sen hoito on tärkeää. Dermatofyytit ovat hidaskasvuisia, ja viljelyssä nopeakasvuiset saprofyyttihomeet voivat peittää ne allensa. PCR:llä ja DNA-sekvensoinnilla osoitettiin dermatofyytti-DNA:ta 42 % sellaisista viljelynäytteistä, jotka viljelyn perusteella olivat saprofyyttipositiivisia, mutta negatiivisia dermatofyyttien suhteen.

Viljelyyn verrattuna PCR oli nopeampi, herkempi ja tarkempi menetelmä.

  • Tutkimuksen laatu: tasokas
  • Sovellettavuus suomalaiseen väestöön: hyvä

Kirjallisuutta

  1. Bergman A, Heimer D, Kondori N ym. Fast and specific dermatophyte detection by automated DNA extraction and real-time PCR. Clin Microbiol Infect 2013;19:E205-11 «PMID: 23402350»PubMed
  2. Bao F, Fan Y, Sun L ym. Comparison of fungal fluorescent staining and ITS rDNA PCR-based sequencing with conventional methods for the diagnosis of onychomycosis. J Eur Acad Dermatol Venereol 2018;32:1017-1021 «PMID: 29405481»PubMed
  3. Sherman S, Goshen M, Treigerman O ym. Evaluation of multiplex real-time PCR for identifying dermatophytes in clinical samples-A multicentre study. Mycoses 2018;61:119-126 «PMID: 29024067»PubMed
  4. Gustafson E, Bakotic W, Bennett L ym. DNA-based detection for onychomycosis correlates better to histopathology than does fungal culture. Dermatol Online J 2019;25: «PMID: 31450272»PubMed